Музей истории донского казачества – старейший музей юга России – был открыт по инициативе «любителей донской старины» 22 ноября 1899 г. Его первым директором стал Харитон Иванович Попов. Здание строилось специально для музея по проекту академика архитектуры А. Ященко. Строительство велось на общественные пожертвования и средства, выделенные войсковой казной. К моменту открытия музею уже были подарены отдельные коллекции (например, старинных монет). К сбору экспонатов привлекались все казачьи станицы Дона. В 1904 г. открылось «Церковно-историческое общество» со своим «древхранилищем», которое помогало комплектовать фонды музея.
В годы гражданской войны, а точнее в конце 1919 г., в связи с отступлением Донской Белой армии к Новороссийску, в спешном порядке без описи были заколочены в ящики и вывезены многие ценные экспонаты Донского музея и Донского архива. Музейный архив претерпел много злоключений, в том числе и грабеж.
В советское время музей перешел на сбор и выставку экспонатов «социалистического реализма», революции и гражданской войны на Дону, экономического развития Дона, показа жизни и быта «красного казачества». Перед началом Великой Отечественной войны в 1941 г. музей преобразовали из Донского в Областной (и единственный в мире) музей истории донского казачества. Во время оккупации немцы вывезли часть экспонатов, в том числе ряд картин известных западноевропейских художников. Часть экспонатов, вывезенных в гражданскую войну, удалось вернуть из Праги только в 1947 г.
В настоящее время Новочеркасский музей истории донского казачества представляет собой сложившийся музейный комплекс, который содержит в своих фондохранилищах реликвии донского казачества. Его богатейшая коллекция не имеет аналогов в мире и насчитывает 115 тысяч экспонатов.
Гордость музея – единственная в мире коллекция казачьих знамен, бунчуков, полковых штандартов донского казачества XVIII-XIX веков. Уникальна и коллекция холодного и огнестрельного оружия того времени, большую часть которого составляет наградное оружие представителей Военного генералитета и офицеров Донского казачьего войска. Но самым главным своим экспонатом коллектив музея считает мемориальные вещи легендарного донского атамана, героя Отечественной войны, основателя города — Матвея Ивановича Платова.
Музей владеет обширной живописной коллекцией, включающей произведения академика живописи, уроженца Новочеркасска Н.Н. Дубовского и русских художников-передвижников, западноевропейскую живопись и графику XVI-XVIII веков, единственную в мире коллекцию парадного казачьего портрета восемнадцатого века «Донская парсуна», собрание портретов «августейших особ».
Большой известностью пользуется научная библиотека музея, где фонд редкой книги составляет более 15 тысяч экземпляров. Сокровищница коллекции – 80 старопечатных книг XVI-XVIII веков.